ABCL

Problemas en el citodiagnóstico de líquidos de punción
Valor del AgNOR

AgNOR en células provenientes de un líquido de punción positivo

La Citología se enfrenta en ocasiones con materiales que son un verdadero desafío aún para un observador experimentado. Un ejemplo de este tipo de muestras son los líquidos de punción, que debido a las características propias del material ( células desprendidas de membranas flotando en el líquido contenido en las cavidades serosas) pueden mostrar alteraciones celulares de difícil interpretación.
Frecuentemente la producción de derrames en dichas cavidades se debe a un tumor maligno metastático y en menor grado a un tumor primitivo de la serosa (mesotelioma). La evaluación citológica de muestras coloreadas con Papanicolaou y Giemsa puede llegar a carecer en muchos casos de la exactitud requerida para establecer un citodiagnóstico correcto.
Teniendo en cuenta lo importante del resultado del examen de estos líquidos, ya que el informe decidirá en la mayoría de los casos la conducta a seguir; existe gran preocupación para aumentar la sensibilidad y especificad del diagnóstico citológico. Lo primero se refiere a evitar que se informen negativas muestras con células neoplásicas (falsos negativos), y lo segundo a que se consideren como malignas células que sólo presentan cambios reactivos (falsos positivos).

El Comité de Redacción de Acta Bioquímica Clínica Latinoamericana ha seleccionado este artículo publicado en la Revista DByM – Diagnóstico Bioquímico y Molecular, Año IV, Nº 5 - 2006, para su difusión a través de FABA Informa

Dra. Adriana Esther Rocher
Dr. Luis Alberto Palaoro
Sección Citología, Departamento de Bioquímica Clínica, Facultad de Farmacia y Bioquímica, Hospital de Clínicas, UBA.

La zona gris de los líquidos de punción

Los materiales con escasas células neoplásicas pueden resultar un gran problema para la observación citológica, pues éstas pueden pasar inadvertidas, sobre todo si se acompañan con elevado número de células benignas.
El resultado sería un informe “falso negativo”, situación muy poco frecuente en el citodiagnóstico de las efusiones. Lo inverso ocurre con mayor frecuencia, y se debe principalmente a la interpretación errónea de células benignas de origen mesotelial como malignas, cuando dichas células muestran cambios morfológicos propios de una elevada reactividad, como se da en reacciones proliferativas del mesotelio como respuesta a estímulos inflamatorios.
También las células que flotan durante mucho tiempo en los líquidos de derrame desarrollan cambios pre-necróticos, que a veces son indistinguibles de alteraciones por cáncer, lo que conduciría a los “falsos positivos”.
En todos los casos descriptos se produce un error en el citodiagnóstico, que dependerá además, en cierta medida, de la experiencia del observador.
Pero ni el más experimentado citólogo puede evitar en su estadística esta “zona gris”, dudosa, de diagnóstico incierto1.
El factor humano explica porqué las sensibilidades informadas en el diagnóstico citológico de los líquidos de punción varíen tanto de un grupo de investigación a otro.

¿Puede disminuírse la zona gris?

Numerosos intentos se han desarrollado en el transcurso de los años con el propósito de aumentar la sensibilidad del citodiagnóstico. Los más antiguos fueron los tradicionales métodos citoquímicos, como la reacción de P.A.S. para investigar polisacáridos provenientes de ciertos tipos de adenocarcinomas secretores.
Posteriormente se incorporaron técnicas como la inmunomarcación, que con alta sensibilidad puede detectar la presencia de ciertas proteínas relacionadas con procesos neoplásicos en las células de los líquidos sospechosos2.
Así, el antígeno carcinoembrionario (CEA) y el antígeno epitelial de membrana (EMA) se revelan en la mayor parte de los adenocarcinomas metastáticos de serosas.
El CEA ofrece una ventaja extra, pues es negativo en los mesoteliomas malignos, que son tumores primitivos de serosas, a veces de difícil diferenciación morfológica con un tumor metastático3.
Pese al enorme número de anticuerpos monoclonales desarrollados para utilizarse como técnica auxiliar en la diferenciación entre células malignas y reactivas en efusiones, existen controversias por resultados contradictorios en muchos de ellos, lo que naturalmente limita su aplicación en los casos de rutina4. Otro problema que “surge al intentar utilizar la metodología de inmunomarcación es el alto costo de los anticuerpos y del sistema de revelado, especialmente en nuestro país, donde todos estos reactivos deben ser importados.
El estudio de la Ploidía (contenido de ADN de las células) significó una gran contribución a la diferenciación de poblaciones diploides (células reactivas) y aneuploides (neoplásicas), pero la implementación de esta técnica requiere coloraciones especiales para ADN (coloración de Feulgen) y un programa de computación que permita la medida del contenido de ADN de 400 núcleos, lo que implica tecnología costosa, consumo de tiempo y personal adiestrado5.
En los últimos años se ha estudiado la aplicación de una técnica que revela las proteínas no histonas asociadas a la zona del organizador nucleolar (NOR), utilizando sales de plata.
Por este motivo se la denominó AgNOR6.

AgNOR y nucleolo

El conjunto de genes que transcriben RNA ribosomal se encuentra en las constricciones secundarias de los cromosomas 13, 14, 15, 21 y 22. El tamaño del nucleolo varía de acuerdo a la necesidad de la célula de generar ribosornas, y como consecuencia incrementa la producción de proteínas.
El número y tamaño de los NOR refleja la actividad, proliferación o transformación de las células. Podría pensarse que una coloración morfológica del nucleolo nos daría información suficiente sobre la capacidad de proliferación de una célula, y, sin embargo, muchos ejemplos muestran que esta relación no siempre se cumple. Basta mencionar que células neoplásicas en necrosis suelen tener grandes nucleolos como consecuencia de un proceso degenerativo, no como índice de su capacidad proliferante.
Por esto se hace necesario una técnica que permita una medida indirecta pero objetiva de la capacidad de división celular. Se ha demostrado que el tamaño nucleolar y la actividad de la RNA polimerasa I en líneas celulares neoplásicas humanas están en relación inversa al tiempo de duplicación de dichas células7. Estos hechos apoyan la idea de la medición del área nucleolar o el recuento de las partículas de AgNOR como parámetros de proliferación celular.
Las células exfoliadas de serosas presentan nucleolo visible: las mesoteliales normales tienen nucleolo pequeño y único, las reactivas pueden aumentar el número de dicha estructura y las adenocarcinomatosas se caracterizan por sus nucleolos grandes y en ocasiones múltiples, de manera que las efusiones son buenas candidatas para la aplicación de técnicas de investigación de proteínas nucleolares8.

Técnica de AgNOR

Las muestras fijadas previamente en etanol 96° se colorean durante 25 minutos en la oscuridad con una solución coloidal de plata obtenida mezclando dos partes de nitrato de plata 5% p/v en una parte de gelatina al 1% p/v en ácido fórmico al 1% v/v. Se lava 3 veces con agua deionizada, luego una vez con solución de tiosulfato al 1% p/v durante 5 min, se deshidrata con xileno y se realiza el montaje en bálsamo de Canadá.
Las partículas de AgNOR se observan como puntos negros dentro de los núcleos.
Queda por decidir la forma de cuantificar los AgNOR. Si se elige el recuento de las partículas (o puntos) de AgNOR, debe elegirse sólo aquellas células que permitan contar todos los puntos, eliminando del cálculo aquellas donde la superposición o proximidad de los puntos impida su individualización. Se cuentan 100 núcleos y se calcula el promedio de partículas presentes (se utiliza el objetivo de inmersión).
Nuestro grupo de trabajo realizó la evaluación de la manera descripta, llegando a establecer los siguientes valores de referencia para la diferenciación entre células reactivas y adenocarcinomatosas en líquidos de punción9:

• Células mesoteliales reactivas: 4,88 partículas de AgNOR por célula (desviación estándar: 1,50)

• Células neoplásicas: 13,17 (desviación estándar: 3,88)

• (diferencia entre las dos poblaciones: p<0,0001)

La otra forma de cuantificación de las proteínas NOR es la medida de las áreas AgNOR en células reactivas y neoplásicas (experiencia no realizada), pero esto implicaría contar con un programa de computación que mida las superficies, lo que no sería posible en muchos laboratorios.

Conclusiones

El recuento de partículas AgNOR en células de líquidos de punción permite clasificar como benignos o malignos aquellas muestras que resultan sospechosas al ser evaluadas sólo con coloraciones morfológicas. Es una técnica fácil, rápida, económica y no requiere instrumental especial, pudiendo realizarse en cualquier tipo de laboratorio.
Como resultado de la evaluación de AgNOR, la que denominamos “zona gris” disminuye notablemente, con el consabido aumento de la sensibilidad y especificidad del método.

Referencias bibliográficas

1. Otherby H, Nadjari B, Friegel P, et al: Diagnostic accuracy of effusion cytology. Diagn Cytopathol 1999; 20:350-7.

2. Leong AS. Immunostaining of cytologic specimens. Am J Clin Pathol 1996; 105:139-40.

3. Polit ti E, Kandaraki C, Apostolopoulou C, Kyritsi T, Koutselini H. Immunocytochemical panel for distinguishing between carcinoma and reactive mesothelial cells in body cavity fluids. Diagnostic Cyt~pathology 2005; 32:151-5.

4. Shield PW, Perkins G, Gordon Wrigtht R. Immunocytochemical staining of cytologic specimen: How Helpful is it? Am J Clin Patho11996; 105: 157-62.

5. Kayser K, Blum S, Beyer M, Haroske G, Kunze KD, Meyer W: Routine DNA cytometry of benign and malignant pleural effusions by means of the remote quantitation server Euroquant: a prospective study. J Clin Pathol 2000; 53: 760-4.

6. Ploton D, Menager M, Jeansson P. Improvement in the staining and the visualisation of the argirophilic proteins of the nucleolar organizer regions at the opticallevel. Histochem J 1986; 18: 5-14.

7. Sujathan K, Kannan S, Raveendran Pillai K. Significance of AgNor count in differentiating malignant cells from reactive mesothelial cells in serous effusions. Acta Cytol 1996; 40:724-8.

8. Carrillo R, Sneige N, EI-Naggar A. Interphase Nucleolar Organizer Regions in the evaluation of serosal cavity effusions. Acta Cytol 1994; 38: 367-72.

9. Rocher AE, Blanco AM, Palaoro L. Utilidad de la técnica de AgNOR en la interpretación de los derrames en cavidades serosas. Rev Med Chile 2000: 128:963-8.